實驗 蛋白質的沉淀反應與顏色反應

一、實驗目的

掌握鑒定蛋白質的原理和方法。熟悉蛋白質的沉淀反應，進一步熟悉蛋白質的有關反應。

二、實驗原理

蛋白質分子中某種或某些集團可與顯色劑作用，產生顏色。不同的蛋白質由于所含的氨基酸不完全相同，顏色反應亦不完全相同。顏色反應不是蛋白質的專一反應，一些非蛋白物質也可產生同樣的顏色反應，因此不能根據顏色反應的結果來決定被測物是否為蛋白質。另外，顏色反應也可作為一些常用蛋白質定量測定的依據。蛋白質是親水性膠體，在溶液中的穩定性與質點大小、電荷、水化作用有關，但其穩定性是有條件的，相對的。如果條件發生了變化，破壞了蛋白質的穩定性，蛋白質就會從溶液中沉淀出來。

三、實驗儀器

1、吸管 2、滴管 3、試管 4、電爐 5、pH試紙 6、水浴鍋7、移液管

四、實驗試劑

1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，3-4層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。

2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸餾水稀釋至200ml。

3、Millon’s試劑：40g汞溶于60ml濃硝酸（水浴加溫助溶）溶解后，冷卻，加二倍體積的蒸餾水，混勻，取上清夜備用。此試劑可長期保存。

4、尿素晶體

5、1%CuSO：1g CuSO晶體溶于蒸餾水，稀釋至100ml 44

6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸餾水，稀釋至100ml

7、濃硝酸

8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀釋至100ml.

9、 冰醋酸

10、濃硫酸

11、飽和硫酸銨溶液：100ml蒸餾水中加硫酸銨至飽和。

12、硫酸銨晶體：用研缽研成碎末。

13、95%乙醇。

14、醋酸鉛溶液：1g醋酸鉛溶于蒸餾水并稀釋至100ml

15、氯化鈉晶體

16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸餾水中并稀釋至100ml

17、飽和苦味酸溶液：100ml蒸餾水中加苦味酸至飽和。 18、1%醋酸溶液。

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蛋白質的沉淀與變性反應

目的

(1)了解蛋白質的沉淀反應、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關系。

(2)學習鹽析和透析等生物化學的操作技術。

原理

在水溶液中，蛋白質分子的表面，由于形成水化層和雙電層而成為穩定

的膠體顆粒，所以蛋白質溶液和其他親水膠體溶液相類似。但是，蛋白質膠 體顆粒的穩定性是有條件的，相對的。在一定的物理化學因素影響下，蛋白 質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，則以固態形式從溶液中析出，這個過程 稱為蛋白質的沉淀反應。這種反應可分為以下兩種類型:

一、可逆淀汲反應

在發生沉淀反應時，蛋白質雖已沉淀析出，但它的分子內部結構并未發

生顯著變化，基本上保持原有的性質，沉淀因素除去后，能再溶于原來的溶 劑中。這種作用稱為可逆沉淀反應，又叫作不變性沉淀反應。屬于這一類的 反應有鹽析作用; 在低溫下，乙醇、丙酮對蛋白質的短時間作用以及利用等 電點的沉淀等。

二、不可逆沉淀反應

在發生沉淀反應時，蛋白質分子內部結構、空間構象遭到破壞，失去原

來的天然性質，這時蛋白質已發生變性。這種變性蛋白質的沉淀不能再溶解 于原來溶劑中的作用叫作不可逆沉淀反應。重金屬鹽、植物堿試劑、過酸、 過堿、加熱、震蕩、超聲波，有機溶劑等都能使蛋白質發生不可逆沉淀反應。

試劑和器材

一、試劑

1．蛋白質溶液

取5m1雞蛋蛋白蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌均勻后用4-8層紗 布過濾，新鮮配制。

2．蛋白質氯化鈉溶液

取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml，充分攪勻

后，以紗布濾去不溶物(加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白)。

硫酸銨粉末，飽和硫酸銨溶液，3%硝酸銀，0.5% 醋酸鉛，10% 三氯醋

酸，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5% 磺基水楊酸(sulfosalicyclic acid)，0.1% 硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1% 醋酸，10% 醋酸，飽和氯化鈉溶液，10% 氫氧化鈉溶液。

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實驗一 蛋白質的顏色反應和沉淀反應

一、實驗目的

（1）掌握鑒定蛋白質的原理和方法

（2）熟悉蛋白質的沉淀反應；進一步掌握蛋白質的有關性質

二、實驗原理

（1）蛋白質顏色反應原理：蛋白質分子中的某些或某種基團與顯色劑作用，可產生特定的顏色反應，是一些常用蛋白質定量測定的依據；但顏色反應不是蛋白質的專一反應；

1、米倫反應原理：米倫試劑是硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物。他能與苯酚及某些二羥基苯衍生物起顏色反應。組成蛋白質的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基團，因此該反應為蛋白質中酪氨酸存在的依據。

2、雙縮脲反應原理：尿素被加熱，則兩分子的尿素放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性環境中，能與硫酸銅結合成紫色的化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質分子中含有肽鍵與縮脲結構相似，故也能進行此反應。雙縮脲反應可作為蛋白質定量測定的依據。

3、黃色反應原理：蛋白質分子中含有苯環結構的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于濃硝酸可反應并生成黃色物質，此物質在堿性環境下變為桔黃色的硝基苯衍生物硝醌酸等。

4、 茚三酮反應原理：蛋白質與茚三酮共熱，產生蘭紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應為一切蛋白質及a-氨基酸所共有。

亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應呈黃色，含有氨基的其他物質亦呈此反應。

（2）蛋白質沉淀反應原理：多數蛋白質是親水膠體，當其穩定因素被破壞或與某些試劑結合成不溶解的鹽后，即產生沉淀。

1、蛋白質的鹽析作用原理：向蛋白質中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質膠體顆粒脫水，破壞其水化層，同時它所帶有的電荷亦被中性鹽上所帶的相反電荷的離子所中和。于是穩定因素被破壞，蛋白質聚集沉淀。鹽析作用一般不使蛋白質變性。

2、有機溶劑沉淀蛋白質原理：某些有機溶劑（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白質脫去水化層以及降低介電常數而增加帶電質點間的相互作用，致使蛋白質顆粒容易凝聚而沉淀

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實驗四 蛋白質的等電點測定和沉淀反應

一、實驗目的

1、了解蛋白質的兩性解離性質。

2、學習測定蛋白質等電點的一種方法。

3、加深對蛋白質膠體溶液穩定因素的認識。

4、了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義。

二、實驗原理

蛋白質是兩性電解質。在蛋白質溶液中存在下列平衡：

蛋白質分子的解離狀態和解離程度受溶液的酸堿度影響。當溶液的PH達到一定數值時，蛋白質顆粒上正負電荷的數目相等，在電場中，蛋白質既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質的等電點。不同蛋白質各有特異的等電點。在等電點時，蛋白質的理化性質都有變化，可利用此種性質的變化測定各種蛋白質的等電點。最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。

本實驗通過觀察不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。

在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質顆�？梢蚴�去電荷和脫水而沉淀。

蛋白質的沉淀反應可分為兩類：

（1）可逆的沉淀反應 此時蛋白質分子的結構尚未發生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質的沉淀仍能溶解于原來溶劑中，并保持其天然性質而不變性。如大多數蛋白質的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質。提純蛋白質時，常利用此類反應。

（2）不可逆沉淀反應 此時蛋白質分子內部結構發生重大改變，蛋白質常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質沉淀與凝固。蛋白質與重金屬離子或某些有機酸的反應都屬于此類。

蛋白質變性后，有時由于維持溶液穩定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質并不一定都表現為沉淀，而沉淀的蛋白質也未必都已變性。

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實驗3 蛋白質的等電點測定和沉淀反應

一、目的

1、了解蛋白質的兩性解離性質。

2、學習測定蛋白質等電點的一種方法。

3、加深對蛋白質膠體溶液穩定因素的認識。

4、了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義。

二、原理

蛋白質是兩性電解質。在蛋白質溶液中存在下列平衡：

蛋白質分子的解離狀態和解離程度受溶液的酸堿度影響。當溶液的PH達到一定數值時，蛋白質顆粒上正負電荷的數目相等，在電場中，蛋白質既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質的等電點。不同蛋白質各有特異的等電點。在等電點時，蛋白質的理化性質都有變化，可利用此種性質的變化測定各種蛋白質的等電點。最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。

本實驗通過觀察不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。

在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質顆�？梢蚴�去電荷和脫水而沉淀。

蛋白質的沉淀反應可分為兩類。

（1）可逆的沉淀反應 此時蛋白質分子的結構尚未發生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質的沉淀仍能溶解于原來溶劑中，并保持其天然性質而不變性。如大多數蛋白質的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質。提純蛋白質時，常利用此類反應。

（2）不可逆沉淀反應 此時蛋白質分子內部結構發生重大改變，蛋白質常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質沉淀與凝固。蛋白質與重金屬離子或某些有機酸的反應都屬于此類。

蛋白質變性后，有時由于維持溶液穩定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質并不一定都表現為沉淀，而沉淀的蛋白質也未必都已變性。

三、材料、試劑與器具 （一）材料

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實驗十一 蛋白質的沉淀反應��

一、目的和要求��

通過實驗加深對蛋白質溶液的溶膠特性及其穩定因素的認識。了解各種沉淀試劑使蛋白質沉淀的實質和區分可逆的鹽析沉淀及不可逆的沉淀作用。��

二、原理

在水溶液中，蛋白質分子表面結合大量的水分子，形成水化膜，同時蛋白質分子本身帶有電荷，與溶液的反離子作用，形成雙電層，因而每個蛋白質分子可形成一個穩定的膠粒。整個蛋白質溶液就形成穩定的親水溶膠體系。與其它溶膠相同，這種穩定性是有條件的，相對的。當某些物理化學因素導致蛋白質分子失去水化膜或失去電荷，甚至變性時，它就喪失了穩定因素，以固態形式從溶液中析出，這就是蛋白質的沉淀作用。根據沉淀作用的結果，可將蛋白質的沉淀作用分為兩類：��

（一）可逆沉淀作用：在發生沉淀作用時，雖然蛋白質已經沉淀析出，然而其分子內部結構并沒發生明顯的改變，仍保持原有的結構和性質。如除去沉淀因素，蛋白質可重新溶解在原來的溶劑中。因此，這種沉淀作用稱為可逆沉淀作用。屬于此類的有鹽析作用，低溫下丙酮、乙醇使蛋白質沉淀的作用，以及利用等電點的沉淀。��

鹽析作用：用大量中性鹽使蛋白質從溶液中析出的過程。在高濃度的中性鹽影響下，蛋白質水分子的水化膜被剝奪。同時蛋白質分子所帶的電荷被中和，因而破壞了蛋白質溶膠的穩定因素，使蛋白質沉淀析出，但中性鹽并不破壞蛋白質的分子結構和性質，因此，若除去中性鹽或減低鹽的濃度，蛋白質就重新溶解。��

有機溶劑沉淀蛋白質：在低溫下，在蛋白質溶液中加入適量丙酮或乙醇，蛋白質分子的水化膜被破壞而沉淀。若及時將蛋白質沉淀與丙酮或乙醇分離，蛋白質沉淀則可重新溶解于水中。��

（二）不可逆沉淀作用：一些物理化學因素往往會導致蛋白質分子結構，尤其是空間結構破壞，因而失去其原來的性質，這種蛋白質沉淀不能再溶解于原來的溶劑中。重金屬鹽，生物堿試劑、過酸、過堿、震蕩、超聲波和有機溶劑等都能使蛋白質發生不可逆沉淀。��

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實驗三 蛋白質的顏色反應和沉淀反應

一、目的：

1.熟悉蛋白質的沉淀反應、顏色反應及其機理。

二、原理：

(一)蛋白質的顏色反應原理

蛋白質分子中的某些基團與顯色劑作用，可產生特定的顏色反應，不同蛋白質所含氨基酸不完全相同，顏色反應亦不同。顏色反應不是蛋白質的專一反應，一些非蛋白物質亦可產生相同顏色反應，因此不能僅根據顏色反應的結果決定被測物是否是蛋白質。顏色反應是一些常用的蛋白質定量測定的依據。

(二)蛋白質的沉淀反應原理

蛋白質的水溶液是一種比較穩定的親水膠體，這是因為蛋白質顆粒表面帶有很多極性基團，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度親和性，當蛋白質與水相遇時，就很容易被蛋白質吸住，在蛋白質顆粒外面形成一層水膜(又稱水化層)。水膜的存在使蛋白顆粒相互隔開，顆粒之間不會碰撞而聚成大顆粒。因此蛋白質在溶液中比較穩定而不會沉淀。蛋白質能形成較穩定的親水膠體的另一個原因，是因為蛋白質顆粒在非等電狀態時帶有相同電荷，使蛋白質顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致相互凝集沉淀。

蛋白質由于帶有電荷和水膜，因此在水溶液中形成穩定的膠體。當某些物理化學因素破壞了蛋白質的水膜或中和了蛋白質的電荷，則蛋白質膠體溶液就不穩定而出現沉淀現象。

三、儀器、試劑和材料

1. 卵清蛋白液：將雞蛋白用蒸餾水稀釋20～40倍，2～3層紗布過濾，濾液冷藏備用。

2. 飽和硫酸銨溶液：稱硫酸銨850g 加于1000mL 蒸餾水中，在70～80℃下攪拌促溶，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。

3. 1%醋酸鉛溶液

4. 1%硫酸銅溶液

5. 0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀釋至100mL。

6. 濃硝酸：比重1.42。

7.試管及試管架、吸管、量筒、布氏漏斗。

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四、操作步驟

(一)蛋白質的沉淀反應

1.鹽析作用：取1支試管加入3mL 蛋白質氯化鈉溶液和3mL 飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置約10min，球蛋白則沉淀析出。過濾后向濾液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解達到飽和為止，析出的沉淀為清蛋白，再加水稀釋，觀察沉淀是否溶解。

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